细胞与基因医治作为医治人类疾病、保护人类健康的很有发展远景的手法之一而备受重视。像一些难治性肿瘤、常见和稀有遗传性疾病，或许运用传统的医治手法难以治好，或许难以运用传统办法来医治，细胞与基因疗法或将成为医治这些疾病的有用手法。
在细胞和基因医治研讨中，病毒基因导入渠道成为首要的基因导入手法。现在常用的病毒载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒等等。与逆转录病毒和腺病毒比较，慢病毒和腺相关病毒因为安全性较好，运用份额大幅进步，但逆转录病毒和腺病毒也有必定运用。
慢病毒是现在细胞与基因疗法研讨，尤其是CAR-T细胞医治，所运用的首要基因导入渠道。慢病毒是单链RNA病毒，一般以人类免疫缺点病毒1型（HIV-1）为根底开发的居多，可用于绝大大都哺乳动物细胞基因导入，包括运用逆转录病毒难以完结的造血干细胞及神经细胞等在内的非割裂细胞。运用重组慢病毒导入的意图基因也能够整合到宿主细胞的基因组中，可完结长时间安稳的基因表达。
慢病毒表达载体是一切慢病毒基因导入体系的要害参加者。野生型慢病毒基因组约为9.7 kb（包括两个LTR）。人工构建大于此长度的基因组，将导致发生不安稳的病毒粒子和病毒滴度的显着下降。关于慢病毒表达载体来说，大部分病毒基因组现已被其他有用的序列所替代，如挑选符号或荧光蛋白质基因，但仍有满足的空间用于意图基因克隆。
因为每个慢病毒表达载体含有的有用序列不同，因而克隆转基因的可用空间也有所不同。通过优化的慢病毒表达载体，除了含有HIV-1 LTR和慢病毒包装信号（），也会包括一些特定元件（cPPT/CTS，RRE，WPRE），这些特定元件的存在有助于改进转基因表达、病毒滴度和全体慢病毒载体功用。
运用重组慢病毒的生物安全问题是，可能会发生致癌病毒或具有仿制才干的重组慢病毒（RCL）。可是这些忧虑，能够通过细心考虑转基因刺进物的性质，并保证病毒仿制仅限于发生在供给这些基本功用的特定包装细胞中，而得到大大缓解。因而，重组慢病毒能够安全运用，是将外源性遗传物质单向转移到靶细胞的有用东西。
重组慢病毒的包装细胞一般为HEK 293T细胞，挑选易于转染并能够高水平表达病毒蛋白的HEK 293T细胞，更有利于取得高病毒滴度。就慢病毒包装体系而言，现在市面上首要是第三代和第四代慢病毒包装体系，我们了解较多的是第三代包装体系，对第四代体系了解较少。
以Lenti-X™第四代慢病毒包装体系为例，这款包装体系Tet-Off和Tat反式激活因子驱动病毒必需成分高水平表达，诱导级联表达反响，然后能够制备出高滴度慢病毒，VSV-G型包装体系病毒滴度可到达107–108IFU/ml。别的，pol基因与vpr基因的交融能够保证反转录酶/整合酶蛋白质能够转运到重组慢病毒颗粒中。
逆转录病毒在基因医治方面有着丰厚的运用实绩，但因为它相对慢病毒更简单引起刺进性随机骤变，近几年来运用较少。逆转录病毒也是单链RNA病毒，一般依据莫罗尼小鼠白血病病毒（MoMLV）开发。逆转录病毒能够将基因导入至大都处于增殖期的细胞中，因为导入基因可整合到染色体中，因而能够完结长时间安稳的基因表达。重组逆转录病毒制备相对简单，但仍然需求在P2级实验室条件下操作。
野生型莫罗尼小鼠白血病病毒（MMLV）基因组约8.2 kb（包括两个LTR）。人工构建一个大于8.2 kb的基因组，相同也会导致发生不安稳的病毒粒子和病毒滴度的下降。与慢病毒表达载体相类似，大部分病毒基因组已被其他有用的序列（如挑选符号或荧光蛋白基因）替代，但仍有满足的空间用于克隆转基因。因为不同逆转录病毒表达载体包括的有用序列不同，因而用于克隆转基因的可用空间也不同。
与慢病毒类似，重组逆转录病毒也会有发生RCL的可能性，所以逆转录病毒包装质粒也会进行特别规划。病毒包装用质粒上刺进有逆转录病毒的结构基因，gag-pol和env基因，这两种基因是逆转录病毒构建和仿制所必需的基因，可是质粒上短少包装信号序列和LTR序列，因而包装用质粒自身是无法包装成逆转录病毒的，只要将其和包括序列和LTR序列的逆转录病毒表达载体共转染到293或许293T包装细胞中，才干包装得到逆转录病毒，发生具有自我仿制才干逆转录病毒的几率也十分低。
为便利运用，能够构建gag和pol基因安稳表达细胞系，作为逆转录病毒包装细胞。这样将含有env基因的表达质粒和克隆了方针基因的表达载体共转染包装细胞，就能够制备出重组逆转录病毒了。这样的包装细胞系，有助于下降转染难度，进步成功率。
作为体内基因导入首要渠道之一，腺相关病毒（AAV）现已在多个遗传性眼科疾病医治临床试验中闪现出有显着的医治作用，而且不会引起明显的不良免疫反响。AAV也是一种广泛运用于癌症基因医治的病毒载体。多种AAV载体已被用于肿瘤医治，很多临床前研讨结果显现，AAV基因医治成功按捺肿瘤成长，致使肿瘤衰退。别的，AAV还广泛运用于血液病、代谢类等疾病的医治研讨，展示出了宽广的运用远景。
因为AAV免疫原性和细胞毒性低，能够转导非割裂细胞，而且整合到宿主基因组中的频率十分低，因而被很多研讨学者以为安全性更高。通过重组和改造的AAV具有不同的血清型，依据血清型不同而具有不同的宿主规模和病毒特征，能够有用作用于特定细胞类型，包括割裂和非割裂细胞类型。运用者需求依据靶标细胞或许安排类型挑选合适的血清型。现在运用频率较高的血清型为AAV2，其它血清型也逐步被广泛运用。
AAV基因组是约4.7 kb的单链线状DNA分子，在两头都有被称为反向结尾重复序列（ITR）的发夹结构。ITR的功用在于基因组仿制开始位点及辅佐病毒粒子包装。AAV基因组包括了3个开放阅读框：Rep编码参加仿制和转录的蛋白质；Cap编码病毒衣壳蛋白质；AAP编码用于病毒粒子构成的非结构蛋白质。Rep区域编码4种不同的蛋白质（Rep78,Rep68, Rep52和Rep40），Cap区域编码3种不同的蛋白质（VP1, VP2 和VP3 ）。
一般来说，AAV只要在辅佐病毒（如腺病毒或疱疹病毒）存鄙人才干仿制。现在，AAV的包装制备大多运用无辅佐病毒包装体系，也就是在不运用辅佐病毒的情况下制备重组AAV。AAV的制备也是通过将编码重组AAV所需因子的质粒转染HEK 293细胞来完结的。制备AAV载体一般需求以下3种质粒：含有意图基因表达框和2个ITR的质粒，包括AAV2 Rep基因和各种血清型Cap基因的质粒，包括腺病毒E2A、E4、VA基因的质粒。
腺病毒是将基因导入哺乳动物细胞的牢靠渠道之一，新近也被运用于基因医治研讨，但现在运用较少。腺病毒的感染不依赖于细胞周期，所以能够将方针基因传递给原代或许通过转化的细胞系。在感染后细胞中，因为重组腺病毒基因组以多仿制方式存在，方针基因将以高水平瞬时表达，腺病毒具有在哺乳动物细胞中高效出产蛋白质的优势。此外，腺病毒能够感染多种不同动物物种的增殖和停止细胞类型，适用规模广。
腺病毒是一种线性双链DNA病毒，现在多运用人5型腺病毒，这种病毒DNA基因组约36 kb，基因组两头包括反向结尾重复序列（ITR）。常用的腺病毒表达载体，删除了前期转录仿制基因E1和E3。因为E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可刺进约8 kb的外源基因。因为腺病毒载体大，克隆难度也高。传统办法是凭借络绎载体作为中心过渡，首先将意图基因克隆到络绎载体，然后再重组到腺病毒病毒DNA上；当然也能够凭借先进的克隆技术（In-Fusion®等）一步完结，高效便利。
E1基因对腺病毒的仿制和转录至关重要，E3基因的缺失不影响腺病毒的仿制。所以腺病毒包装必需依赖于表达E1基因的细胞系，比方HEK-293等。在包装前，需求将克隆了意图基因的重组腺病毒载体线性化，以露出坐落腺病毒基因组两头的反向结尾重复序列（ITR），并从质粒骨架开释腺病毒基因组。原因是ITR包括腺病毒DNA仿制起点，有必要坐落线性腺病毒DNA分子的结尾，以支撑仿制复合物的构成。
线性化重组腺病毒载体转染HEK-293包装细胞，大约一周左右能够收成重组病毒。这部分病毒将被作为病毒种子再感染HEK-293包装细胞，使其自我仿制来取得更高病毒滴度，再次搜集病毒感染方针细胞。
Takara Bio想必我们并不生疏，乃至可能是很熟悉了。Takara Bio作为重要的生物技术企业，在病毒基因导入体系方面造就颇深、体系齐备，具有慢病毒体系、逆转录病毒体系、腺相关病毒体系、腺病毒全套解决方案，为细胞与基因医治研讨护航加码。
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